Il Palazzo fu costruito dai Gaddi, ricca famiglia di mercanti fiorentini, agli inizi del XVI secolo e poco dopo acquistato dai Cesi, nobile famiglia di origine umbra.
Federico Cesi duca di Acquasparta si insediò nell'edificio dopo aver sposato Isabella Salviati, e per questo lo stemma composito Cesi-Salviati corona ancora oggi il portale. Personalità vivace, di grande cultura, appassionato di scienze, Federico istituì nel proprio palazzo un interessante orto botanico e fondò qui l'Accademia Nazionale dei Lincei, accogliendo quindi spesso nei suoi saloni gli scienziati dell'epoca, tra cui Galileo Galilei di cui era amico personale. Appassionati d'arte, i Cesi avevano anche una collezione di statue antiche e nel giardino del palazzo furono riportate alla luce due statue di re di Numidia oggi esposte ai Musei Capitolini.
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