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La Iglesia, que se encuentra pasando la Porta Sant'Anna, una de las entradas a la Ciudad del Vaticano, resulta ser el sólo espacio de oración entre las murallas del Vaticano que está permitido al público.
La historia de la misma empezó el año 1565 se relaciona estrechamente con los Palafrenieri (o Parafrenieri) papales, personajes de la corte que en su origen se ocupaban de las caballerizas papales y cuya protectora era Santa Ana.
En el pasado, la confraternidad utilizaba la capilla consagrada a la Santa en San Pedro: con la concesión por el Papa Pío IV sobre la construcción de una iglesia en Borgo Pio, los Palafrenieri comisionaron al arquitecto Giacomo Barozzi, más conocido como Vignola, considerado entre los más brillantes de la arquitectura renacentista, y cuya obra no ha perdido relevancia en los siglos sucesivos.
La iglesia de Santa Ana, fundada el año 1583, representa en Roma un testimonio de planta elíptica interior utilizada más adelante en otros sitios de culto, como por ejemplo en Sant'Andrea al Quirinale y San Carlo alle Quattro Fontane.
En los comienzos del siglo XVIII, la parte delantera fue modificada por primera vez: el arquitecto Alessandro Specchi ideó la cornisa en ambos lados del frontal y los dos campanarios con bóveda en forma de cebolla.
Los angelitos colocados en los lados del frontón han sido realizados por los escultores Michael Maille y Francesco Moderati y reproducen el espíritu barroco tardío de la época con sus amplios y voluminosos drapeados y con los marcados contrastes de luz y sombras.
Al principio, las paredes interiores de la iglesia eran blancas, pero en el siglo XVIII, bajo la influencia del estilo barroco, se pintaron de azul claro, crema y gris y se decoraron con estucos.
Los angelitos de yeso que sostienen las guirnaldas por encima de las puertas y las conchas decoradas con festones donde están colgados ilusamente los cuatro frescos que representan episodios de la vida de Santa Ana son obra del escultor Giovan Battista de Rossi.
Aunque la decoración resulte muy rica, no se modificaron las principales características del interior y se mantiene la arquitectura del siglo XVI. El altar mayor exhibió por poco tiempo la Madonna dei Palafrenieri de Caravaggio que fue comisionado por la Cofradía al artista el 31 de octubre de 1605: el cuadro no tuvo gran éxito y fue así vendido al cardenal Scipione Borghese.
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