Diese Kirche, die gleich hinter der Porta Sant’Anna, einem der Eingänge zur Vatikanstadt, liegt, ist die einzige öffentlich zugängliche Gebetsstätte innerhalb der Vatikanmauern. Ihre Geschichte beginnt im Jahr 1565 und ist eng mit den päpstlichen Palafrenieri (Stallknechte) verbunden, Herren des Hofes, die ursprünglich für die päpstlichen Stallungen zuständig waren und deren Schutzpatronin die heilige Anna war. Als sie jedoch von Papst Pius IV. die Erlaubnis erhielten, eine Kirche in Borgo Pio zu errichten, vertrauten die Palafrenieri das Bauprojekt dem Architekten Giacomo Barozzi (als Vignola bekannt) an, einem der berühmtesten Namen der Renaissance-Architektur, dessen Spuren trotz der Veränderungen und Restaurierungen der folgenden Jahrhunderte noch immer deutlich sichtbar sind.
Die 1583 eingeweihte Kirche Sant’Anna ist eines der frühesten Beispiele in Rom für eine Kirche mit elliptischem Grundriss, eine Form, die später in vielen anderen Gotteshäusern aufgegriffen wurde, zum Beispiel in Sant’Andrea al Quirinale und San Carlo alle Quattro Fontane. Zu Beginn des 18. Jahrhunderts wurde die Fassade zum ersten Mal umgestaltet. Der Architekt Alessandro Specchi schuf die Balustrade zu beiden Seiten des Giebels und die beiden Glockentürme mit Zwiebelhauben. Die Engel zu beiden Seiten des Giebels sind das Werk der Bildhauer Michael Maille und Francesco Moderati und spiegeln mit ihren schweren, weiten Faltenwürfen und den starken Licht- und Schattenkontrasten den spätbarocken Geschmack der Zeit wider.
Die Innenwände der Kirche waren ursprünglich weiß, doch im 18. Jahrhundert wurden sie unter dem Einfluss des Barockstils blau, cremefarben und grau gefärbt und mit Stuck verziert. Ein Werk des Bildhauers Giovan Battista de Rossi sind die Stuck-Engel, die Girlanden über den Türen halten, und die Muscheln mit Girlanden, an denen die vier Fresken mit Episoden aus dem Leben der Heiligen Anna illusorisch aufgehängt sind. Trotz der reichen Ausschmückung wurden die wesentlichen Linien des Innenraums nicht verändert, und der Grundriss des 16. Jahrhunderts ist noch erkennbar. Der Hochaltar beherbergte kurzzeitig Caravaggios Madonna der Palafrenieri (Madonna mit der Schlange), die die Bruderschaft am 31. Oktober 1605 bei dem Künstler in Auftrag gegeben hatte: Das Gemälde war jedoch kein Erfolg und wurde an Kardinal Scipione Borghese verkauft.
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