Les origines du complexe remontent à 727 après Jésus-Christ, lorsque le roi saxon Ina créa la "Schola Saxonum" pour accueillir les pélerins qui se rendaient au tombeau de l'apôtre Pierre. La Schola Saxonum a été érigée sur l'ancien site des "Horti" d'Agrippina Maior (14 avant Jésus-Christ - 33 après Jésus-Christ), des bâtiments impériaux et de vastes et somptueux jardins qui s'étendaient de la colline du Janicule jusqu'à la rive droite du Tibre. Dans certaines des salles situées sous l'ancien hôpital, des vestiges de murs en opus reticulatum, de sols en mosaïque, de sculptures et de fresques sont encore visibles.
Considéré comme l'un des plus anciens hôpitaux d'Europe, le Santo Spirito in Sassia a été construit pour accueillir les pauvres, les malades et les enfants abandonnés, comme en témoigne encore aujourd'hui la roue des exposés à l'extérieur du bâtiment.
Restauré et agrandi au fil des siècles, le complexe se compose des Corsie Sistine, des Cloîtres des Frères, des Sœurs et des Fileuses (ou "Cloître du Puits") et enfin du Palais du Commendataire (une extension du XVIe siècle), œuvre de l'architecte Giovanni Lippi.
Le palais, construit autour d'une élégante cour quadrangulaire, est orné d'une fontaine du XVIIe siècle et d'une horloge à six heures du XIXe siècle. Il abrite l'ancienne Spezieria, où étaient menées de nombreuses recherches pharmaceutiques et où l'on broyait des herbes médicinales, ce dont témoignent aujourd'hui les collections de vases et de mortiers anciens.
Objet d'une restauration minutieuse achevée en juillet 2022, les Corsie Sistine ont été construites à la demande du pape Sixte IV della Rovere dans la seconde moitié du XVème siècle. La structure, composée des Corsie Lancisi et Baglivi, mesure 120 mètres de long et 13 mètres de large. Les couloirs ont d'abord été utilisés comme lieu d'hospitalisation et, à partir du XVIIème siècle, comme lazaret. Un cycle de fresques des écoles de l'Ombrie et du Latium, d'une superficie de plus de 1200 mètres carrés et qui n'a rien à envier à celui de la Chapelle Sixtine, orne le périmètre supérieur. Les nefs sont reliées par un tiburium octogonal sous lequel on peut admirer la seule œuvre romaine d'Andrea Palladio, un ciborium raffiné surmonté de deux putti attribués à Andrea Bregno, qui a également conçu les deux majestueux portails d'entrée.
Au cours des siècles suivants, le complexe hospitalier s'est encore développé, avec la construction de la Salle de l'Hôpital d'Alexandrie, qui abrite aujourd'hui le Musée de l'Histoire de l'Art Sanitaire.
À l'intérieur, plusieurs collections importantes sont conservées : près de 400 pièces, dont des céramiques et de la verrerie pharmaceutique, des tapisseries, des sculptures et des reliefs ; environ 300 peintures, dessins et gravures, de nombreuses fresques, grotesques et autres décorations murales ; 20 000 volumes imprimés, dont une soixantaine d'incunables, 2. 000 cinquecentins et 374 manuscrits précieux de différentes époques, deux codex en parchemin des écrits d'Avicenne et le plus connu Liber Fraternitatis Sancti Spiritus ; deux globes de Vincenzo Coronelli (un globe terrestre et un globe céleste de 1600) ; deux sphères armillaires en laiton et un dioptre utilisé en arpentage pour déterminer et tracer des vues, témoignages uniques de la culture scientifique romaine à l'époque moderne.
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